Isidoro nasceu em Sevilha, Espanha, no ano de 560, seus pais sendo católicos de origem nobre entre os godos de Cartagena. Quarto e último dos irmãos, todos santos (Santos Leandro e Fulgêncio e Santa Florentina); Leandro, arcebispo de Sevilha, cuidou dele após a morte prematura dos pais.
Nesta época a Espanha sofria ainda com as consequências das invasões ao final do antigo Império Romano, e tais hordas conquistadoras, crendo que Roma havia caído militarmente por causa da cultura, esforçavam-se para destruir os livros. São Leandro, responsável pela conversão do rei Recaredo, havia construído dois mosteiros, um masculino, onde foi abade, e outro feminino, onde Santa Florentina foi abadessa.
Nos mosteiros, além da formação na Fé, preservava-se da extinção a cultura greco-romana, e no mosteiro Isidoro aprendeu igualmente aritmética, gramática, geometria, música, retórica, dialética, astronomia, Latim, Grego, Hebraico. Contudo, inicialmente tinha imensas dificuldades para aprender; mas certo dia, evitando o colégio, sentou-se próximo a um poço de dura pedra, onde notou ranhuras profundas na borda, e descobriu que haviam sido feitas pelas cordas que, diariamente e por muito tempo, faziam subir os recipientes com água. Entendeu assim o valor da perseverança, e voltando às aulas, aplicou-se nos estudos, vindo a se tornar o maior Doutor da Igreja na Espanha: dizia-se dele ter a penetração de Platão, o conhecimento enciclopédico de Aristóteles, a erudição de Orígenes, a doutrina de Santo Agostinho, e a eloquência de Cícero.
Escreveu muito, fazendo principalmente um imenso trabalho de compilação e ordenação, sendo sua obra mais conhecida (e considerada a primeira enciclopédia da História) os 20 volumes das “Etimologias”, incluindo todos os ramos da ciência e conhecimento do seu tempo: I. Gramática; II. Retórica e Dialética; III. Matemática, Música e Astronomia; IV. Medicina; V. Direito e Cronologia; VI. Bíblia e outros livros; VII. Teologia; VIII. A Igreja e as seitas; IX. Línguas e Povos; X. Lexicologia; XI. Anatomia; XII. Zoologia; XIII. Geografia; XIV. Geografia; XV. Arquitetura e agrimensura; XVI. Mineralogia; XVII. Agricultura; XVIII. Guerra e torneios; XIX. Navios e casas; XX. Alimentos e ferramentas. Além de salvar desse modo a cultura antiga, escreveu também sobre Filosofia, História, controvérsias, exegese, comentários bíblicos, linguística, Direito Canônico; uma regra de vida monástica; Ofícios Divinos.
Isidoro, como o irmão Leandro, entrou para a vida monástica, e foi ordenado sacerdote em 589. Quando são Leandro deixou a abadia, proclamado Arcebispo de Sevilha e logo depois conselheiro do rei Recaredo, o jovem mas maduro Isidoro ficou no seu lugar. E grande foi o seu trabalho, pois a disciplina monacal estava abalada pelas falsas vocações (muitos tomavam os votos só pelo prestígio de religiosos), e por muitos que desleixavam a necessária convivência comunitária. Escreveu então a Regula Monachorum e, pelo exemplo de humildade, oração, trabalho, abnegação, iniciou a reforma de costumes para tornar o próprio mosteiro referência para a vida religiosa da Península Ibérica. Sua Regra, uma das primeiras que abolia castigos corporais, unia trabalho manual e intelectual, com incentivo à leitura e meditação, e cópias de obras clássicas para distribuição em outros mosteiros. Frisava que o estudo faz parte das obrigações do religioso. Instituiu normas de caridade entre os irmãos; prescreveu o hábito religioso pobre e modesto, mas não miserável, “para não produzir tristeza no coração, nem ser motivo de soberba”.
Como professor, destacou-se na célebre Escola de Sevilha que dirigia, onde se formaram São Bráulio (ao qual dedicou as “Etimologias”) e Santo Ildefonso, além de nobres, como os reis Sisenando e Sisebuto (ao qual dedicou o livro “De Natura Rerum”).
Ao falecer São Leandro, por volta de 600, Isidoro, com 43 anos, foi aclamado Arcebispo em seu lugar. Zelou então pela esmerada formação espiritual, intelectual e de comportamento do clero, fundando núcleos escolares nas casas religiosas, precursores dos seminários atuais. Igualmente ou mais, cuidou do esplendor da Liturgia, chegando a compor hinos para a música sacra que introduziu nos atos litúrgicos. Unificou as rubricas litúrgicas no reino e criou a Collectio Canonum Ecclesiæ Hispanæ, uma compilação completa de decretais e cânones conciliares, que regeu a Igreja espanhola até a reforma gregoriana. Suas pregações atraíam multidões de fiéis. Convocou e presidiu o II Concílio de Sevilha (619) e o IV Concílio de Toledo (633). Em nenhum momento Isidoro, apesar da sua gigantesca atividade, deixou em segundo plano a oração, as mortificações e penitências, e a caridade, de modo que em sua casa sempre compareciam pobres e necessitados. Continuou combatendo, como São Leandro, a heresia ariana.
Sisebuto, seu ex-aluno, foi coroado rei em 612 e muito ajudou Isidoro a consolidar os direitos da Igreja. Mas quando necessário, o santo não hesitava em chamar-lhe atenção, se se imiscuía nos assuntos eclesiásticos.
Seus esforços frutificaram, seu exemplo levou muitos à leitura e ao estudo, e à busca da santidade. Influenciou enormemente a cultura espanhola e europeia, como homem mais culto do século, ao longo de quase 40 anos de maravilhosa ortodoxia episcopal.
Faleceu em sua cela a 4 de abril de 636, aos 76 anos. Declarado Doutor da Igreja, é, junto com São Leandro, o último dos Padres da Igreja (expoentes da Patrística) latinos. Santo Isidoro e seus irmãos ficaram conhecidos como os Quatro Santos de Cartágena. Foi considerado por São João Paulo II um dos padroeiros da internet, em razão da sua prolífica obra de divulgação.